Искусственные питательные среды для бактерий

Искусственные питательные среды для бактерий

Питательной средой в микробиологии называют среды, содержащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения бактерий или других микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях.

Питательные среды готовят из продуктов животного или растительного происхождения. Большое значение имеет наличие в питательной среде ростовых факторов, которые катализируют метаболические процессы микробной клетки (витамины группы В, никотиновая кислота и др.).

Искусственные среды готовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и азотистых веществ.

Питательные среды служат местом обитания микроорганизмов и источником питательных веществ, где они осуществляют все обменные процессы — рост, размножение, гибель.

Среды должны содержать вещества, необходимые для построения микробной клетки, а также источники энергии. В состав сред входят макро- и микроэлементы, органогены (азот, углерод, кислород, водород) и факторы роста (витамины, некоторые аминокислоты, гормоны и т. д.).

Все перечисленные вещества и элементы должны находиться в легкоусвояемой форме.

Следует готовить общеупотребительные питательные среды, чтобы они были пригодны для выращивания многих или хотя бы нескольких видов микроорганизмов. Желательно, чтобы они в то же время были унифицированными, т. е. содержали постоянные количества отдельных ингредиентов, например аминного азота — 80—120 мг %, общего азота — 250— 300 мг %, NaCL – 0,5-0,8 % и т. д.

Среды должны иметь определенную кислотность. Так, для большинства бактерий оптимальной, т. е. обеспечивающей наилучшие условия развития, является нейтральная или слабощелочная среда — рН 7,0—7,4. Для успешного выращивания дрожжей, плесневых грибов активная кислотность сред должна находиться в пределах рН 4,5—6,5. Кислотность сред регулируется добавлением растворов соляной, молочной кислот или пищевой соды.

Чтобы во время роста микробов кислые или щелочные продукты их жизнедеятельности не изменяли оптимального значения рН, среды должны обладать буферностью, т. е. содержать вещества, способные нейтрализовать кислые или щелочные продукты обмена.

Среды должны содержать достаточное количество влаги (около 80 % и более).

Питательными средами для микроорганизмов могут являться обычные пищевые продукты — молоко, мясной или рыбный бульон, овощи, фрукты или их отвары. Чаще используют искусственные питательные среды, т. е. среды, приготовленные с добавлением каких-либо дополнительных веществ. Им придаются свойства, позволяющие легко наблюдать за развитием микроорганизмов (по изменению прозрачности, цвета, консистенции и др.) и изучать их.

В бактериологической практике чаще всего используют сухие питательные среды, которые получают на основе достижений современной биотехнологии. Для их приготовления используют экономически рентабельное непищевое сырье: утратившие срок годности кровезаменители (гидролизин—кислотный гидролизат крови животных, аминопептид — ферментативный гидролизат крови; продукты биотехнологии (кормовые дрожжи, кормовой лизин, виноградная мука, белколизин). Сухие питательные среды могут храниться в течение длительного времени, удобны при транспортировке и имеют относительно стандартный состав.

По консистенции питательные среды могут быть жидкими, полужидкими, плотными. Плотные среды готовят путем добавления к жидкой среде 1,5—2% агара, полужидкие — 0,3— 0,7 % агара. Агар представляет собой продукт переработки особого вида морских водорослей, он плавится при температуре 80—86°С, затвердевает при температуре около 40°С и в застывшем состоянии придает среде плотность. В некоторых случаях для получения плотных питательных сред используют желатин (10—15%). Ряд естественных питательных сред (свернутая сыворотка крови, свернутый яичный белок) сами по себе являются плотными.

По целевому назначению среды подразделяют на основные, элективные и дифференциально-диагностические.

К основным относятся среды, применяемые для выращивания многих бактерий. Это триптические гидролизаты мясных, рыбных продуктов, крови животных или казеина, из которых готовят жидкую среду — питательный бульон и плотную — питательный агар. Такие среды служат основой для приготовления сложных питательных сред — сахарных, кровяных и др., удовлетворяющих пищевые потребности патогенных бактерий.

Элективные питательные среды предназначены для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида (или определенной группы) из материалов, содержащих разнообразную постороннюю микрофлору. При создании элективных питательных сред исходят из биологических особенностей, которые отличают данные микроорганизмы от большинства других. Например, избирательный рост стафилококков наблюдается при повышенной концентрации хлорида натрия, холерного вибриона — в щелочной среде и т. д.

Дифференциально-диагностические питательные среды применяются для разграничения отдельных видов (или групп) микроорганизмов. Принцип построения этих сред основан на том, что разные виды бактерий различаются между собой по биохимической активности вследствие неодинакового набора ферментов.

Особую группу составляют синтетические и полусинтетические питательные среды. В состав синтетических сред входят химически чистые вещества: аминокислоты, минеральные соли, углеводы, витамины. В полусинтетические среды дополнительно включают пептон, дрожжевой экстракт и другие питательные вещества. Эти среды чаще всего применяют в научно-исследовательской работе и в микробиологической промышленности при получении антибиотиков, вакцин и других препаратов.

В последние годы в целях экономии питательных сред и ускоренной идентификации некоторых микроорганизмов (энтеробактерии, стафилококки, стрептококки и др.) применяются так называемые микротест-системы (МТС). Они представляют собой полистироловые пластины с лунками, в которых содержатся стерильные дифференциально-диагностические среды. Стерилизацию МТС проводят УФ-облучением. Микротест-системы особенно удобны при массовых бактериологических исследованиях в практических лабораториях.

Требования, предъявляемые к питательным средам

Любая питательная среда должна отвечать следующим требованиям: содержать все необходимые для размножения микроорганизмов вещества в легкоусвояемой форме; иметь оптимальные влажность, вязкость, рН, быть изотоничной и по возможности прозрачной. Каждую питательную среду стерилизуют определенным способом в зависимости от ее состава.

Синтетические питательные среды — среды с известным количественным и качественным составом ингредиентов. Они обычно состоят из аминокислот, аммонийных, азотнокислых и других солей, углеводов, ростовых факторов и стимуляторов роста. Полусинтетические среды, кроме синтетической основы, содержат незначительное количество кислотного, триптического, дрожжевого, грибного, казеинового гидролизата, альбумина или нативной сыворотки крови.Синтетические питательные среды. применяют в производственных условиях, для изучения питательных потребностей, выращивания культур клеток.

biofile.ru

Тема 9. Культивирование микроорганизмов в лабораторных условиях

1. Питательные среды в микробиологии.

2. Культивирование аэробных и анаэробных микроорганизмов.

3. Методы количественного учета микроорганизмов.

4. Методы хранения культур микроорганизмов.

1. Питательные среды в микробиологии

Для культивирования микроорганизмов используются различные по составу питательные среды, в которых должны содержаться все вещества, необходимые для роста. Потребности микроорганизмов в питательных веществах чрезвычайно разнообразны и определяются особенностями их метаболизма. Поэтому универсальных сред, одинаково пригодных для роста всех микроорганизмов, не существует.

В широком смысле слова питательная среда должна соответствовать следующим требованиям:

1) включать доступный для клетки источник энергии. Для одних организмов (фототрофов) таким источником служит свет, для других – органический (хемоорганотрофы) или неорганический (хемолитотрофы) субстрат.

2) содержать все необходимые компоненты для реализации конструктивных процессов в клетке. Причем синтетические способности микроорганизмов могут варьировать от использования углекислого газа в качестве единственного источника углерода (автотрофы) до потребности в более восстановленных соединениях углерода – кислотах, спиртах, углеводах и др. (гетеротрофы).

В узком смысле слова любая искусственная питательная среда должна соответствовать следующим требованиям: содержать все необходимые для роста питательные вещества в легко усвояемой форме; иметь оптимальную влажность, оптимальную вязкость, оптимальную рН, (оптимальные – для конкретного микроорганизма), быть изотоничной, сбалансированной с высокой буферной емкостью и, по возможности, прозрачной.

Питательной средой в микробиологии называют среды, содержащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения микроорганизмов, их культивирования и сохранения в лабораторных или промышленных условиях.

Выбор состава питательной среды зависит в значительной степени от целей эксперимента либо промышленного процесса.

Существует следующая классификация питательных сред:

По составу питательные среды делятся на натуральные, синтетические и полусинтетические. Также они могут классифицироваться как среды определенного и неопределенного состава. Натуральными называют среды, которые состоят из продуктов растительного или животного происхождения, имеющих неопределенный химический состав. Примерами питательных сред такого типа являются среды, представляющие собой смесь продуктов распада белков (казеина, мышц млекопитающих), образующихся при их гидролизе. К питательным средам неопределенного состава можно отнести и среды, полученные на основе растительного сырья: картофельный агар, томатный агар, отвары злаков, дрожжей, пивное сусло, настои сена и соломы и др. Основное назначение таких питательных сред – выделение, культивирование, получение биомассы и поддержание культур микроорганизмов.

К числу сред неопределенного состава относят и среды полусинтетические. В такую среду вносят известные соединения как явно необходимые; а также добавляют небольшое количество дрожжевого или кукурузного экстракта (или любого другого природного продукта) для обеспечения неизвестных потребностей роста. Такие среды часто используются в случае промышленного культивирования биологических объектов для получения продуктов метаболизма, например, для получения аминокислот, антибиотиков, витаминов и т.д.

Синтетические среды – это среды определенного состава, представленные чистыми химическими соединениями, взятыми в точно указанных концентрациях и соотношениях отдельных элементов. Обязательными компонентами таких сред являются неорганические соединения (соли) и углерод- и азотсодержащие вещества (типичными представителями являются глюкоза и (NH4)2SO4. Часто к таким средам добавляют буферные растворы и хелатирующие соединения. Основное назначение таких питательных сред – изучение особенностей физиологии и метаболизма микроорганизмов, выделение генетических рекомбинантов и т. д.

По назначению среды разделяют на основные, элективные (селективные) и дифференциально-диагностические. К основным относятся среды, применяемые для выращивания многих бактерий. Это питательный бульон и питательный агар. Такие среды служат основой для приготовления более сложных питательных сред. Элективные среды обеспечивают преимущественное развитие одного или целой физиологической группы микроорганизмов. Например, для выделения стафилоккоков в среду может быть добавлен хлористый натрий в концентрации 7,5 %. При этой концентрации рост других бактерий подавляется. Элективные среды применяются на первом этапе выделения чистой культуры бактерий, т. е. при получении накопительной культуры.

Дифференциально-диагностические среды применяются для быстрой идентификации близкородственных видов микроорганизмов, для определения видовой принадлежности, в клинической бактериологии и др. В состав дифференциально-диагностической среды входят: а) основная питательная среда, обеспечивающая размножение бактерий; б) определенный химический субстрат, отношение к которому является диагностическим признаком для данного микроорганизма; в) цветной индикатор, изменение окраски которого свидетельствует о биохимической реакции и наличии данной ферментной системы у исследуемого микроорганизма. Например, среда Эндо позволяет отличить клоны, сбраживающие лактозу от клонов, не обладающих этим свойством.

По консистенции среды могут быть жидкими, полужидкими, твердыми, сыпучими. Жидкие питательные среды получают при растворении в воде определенного необходимого набора питательных веществ, макро- и микроэлементов. По составу они могут быть как натуральными, так и синтетическими.

Среды в твердом состоянии в форме плотных гелей используются в бактериологии со времен Р. Коха. Наиболее важным преимуществом использования твердых сред является то, что на них можно выращивать микроорганизмы в виде колоний, образующихся из отдельных клеток популяции. Приготовление твердых питательных сред достигается добавлением к жидким средам определенных уплотнителей, в качестве которых могут выступать агар, желатина, силикагель, каррагенан.

Полужидкие среды содержат гелеобразующее вещество в низкой (0,3 – 0,7 %) концентрации и имеют мягкую желеподобную консистенцию. Такие среды пригодны для изучения подвижности и хемотаксиса клеток, культивирования микроаэрофилов.

Сыпучиесреды представляют собой массу в той или иной степени измельченного и увлажненного сырья (обычно, растительного). Основное их назначение – использование в пищевой промышленности (получение соевого соуса или рисовой водки), сельском хозяйстве (силосование кормов) и т. д.

В бактериологической практике чаще всего используются сухие питательные среды, которые получают в промышленных масштабах – триптические гидролизаты дешевых непищевых продуктов (рыбные отходы, мясокостная мука, технический казеин) с добавлением агара. Сухие среды являются достаточно дешевым сырьем, могут храниться в течение длительного времени, удобны при транспортировке, имеют относительно стандартный состав, на их основе быстро и легко готовить питательные среды.

studfiles.net

ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Читайте также:

  1. Cостав микрофлоры основных заквасок, применяемых в молочной промышленности. Принципы подбора культур в состав заквасок.
  2. D.2 Идентификация затрат на основные действия
  3. I. Основные задачи обеспечения безопасности и информации в информационных системах
  4. I. ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ И ПОЛОЖЕНИЯ ЗАЩИТЫ ИНФОРМАЦИИ В КОМПЬЮТЕРНЫХ СИСТЕМАХ
  5. I. Основные теории происхождения государства и права.
  6. I. Понятие, признаки, принципы, цели юридической ответственности.
  7. II. Принципы, требования и гарантии законности.
  8. II.Принципы принятия инвестиционных решений
  9. А. Колониальная система: основные этапы.
  10. Актуальность и основные понятия функции контроля
  11. Арбитражные суды, их роль и основные задачи
  12. Арматура. Её основные физико-механические свойства. Арматурные изделия

Для выделения чистой культуры микроорганизмов, изучения их биологических свойств с целью идентификации, а также для получения биомассы необходимо размножить микроорганизмы в условиях лаборатории. Культивирование, или выращивание, микробов возможно лишь при создании определенных условий для их жизнедеятельности. Большинство бактерий, дрожжей, плесеней культивируют на искусственных питательных средах. Вирусы и риккетсии размножаются только в живых клетках, культуре тканей, курином эмбрионе или в организме животного.

Искусственные среды, применяемые для культивирования микроорганизмов, должны соответствовать определенным требованиям: быть легкоусвояемыми, с необходимым составом’азотистых и углеводных веществ, витаминов, необходимой концентрацией солей, с определенным водородным показателем (рН среды); обладать буферными свойствами; иметь оптимальный окислительно-восстановительный потенциал.

Питательные среды должны также содержать достаточное количество воды и обязательно быть стерильными, т. е. до посева не содержать микроорганизмов. Источником азота в средах могут быть различные органические, редко — неорганические соединения. Часто к безбелковым средам добавляют пептон, представляющий собой продукт неполного гидролиза белка. Протеолитические микроорганизмы в качестве азотистого вещества могут использовать желатин («животный студень»). Источником углерода в питательных средах чаще служат углеводы, спирты, некоторые органические кислоты.

Для приготовления искусственных питательных сред можно использовать различные естественные продукты: молоко, кровь, сыворотку, мясо, желток куриного яйца, картофель и другие органические вещества и минеральные соли.

Искусственные питательные среды по назначению подразделяют на четыре основные группы: универсальные, специальные, избирательные (элективные) и дифференциально-диагностические.

К универсальным средам относят мясо-пептонный бульон и мясо-пептонный агар, на которых растут многие виды патогенных и непатогенных бактерий.

Специальные среды применяют для выращивания бактерий, не множающихся на универсальных средах. К специальным относят еды с молоком, сывороткой крови, с добавлением крови животных,т-чюкозы и др. На них выращивают молочнокислые бактерии, паТогенные и другие микроорганизмы.

В избирательных (элективных) средах хорошо развиваются только бактерии определенных видов. К таким средам относятся среды обогащения, в которых интересующий исследователя вид растет быстрее сопутствующих бактерий. Например, среда Кесслер, содержащая в своем составе генцианвиолет и желчь крупного рогатого скота, элективна для устойчивых к этим веществам грамотрицательных кишечных палочек и вместе с тем селективна для чувствительных грамположительных

Дифференциально-диагностические среды используют для дифференциации определенных видов бактерий по их культуральным и биохимическим свойствам. К ним относятся:

среды для определения протеолитической активности (мясопептонный желатин — МПЖ, молочный агар и др.);

среды для определения ферментации углеводов (среды Гисса, Эидо, Плоскирева и др.);

среды для определения гемолитической способности (кровяной агар и другие среды с добавлением крови животных);

среды для определения восстановительной (редуцирующей) способности микроорганизмов (среда Вильсон-Блера);

селективные среды, применяемые для дифференциации прототрофных и ауксотрофных бактерий.

По консистенции питательные среды могут быть плотными, полужидкими и жидкими. Для получения сред плотной консистенции к жидким средам добавляют 2-2,5 % агара или 10-20 % желатина. Полужидкие среды получают при добавлении 0,5- 1,0 % агара. Агар (по-малайски «желе») — плотное волокнистое вещество, получаемое из красных водорослей и образующее в водных растворах плотный гель (студень). Он состоит в основном из полисахаридов (70-75 %). Основными компонентами агара являются высокомолекулярные вещества агароза и агаропептин, которые не расщепляются и не усваиваются микроорганизмами. В связи с этим агар не является питательным субстратом, его добавляют в среды исключительно для получения плотной консистенции. Агар расплавляется в воде при 100 °С, а застывает при 40-43 °С. Его выпускают в виде желтоватых пластинок или серовато-белого порошка.

Осмотические условия, необходимые для жизнедеятельности микробов, создают в питательной среде добавлением хлорида натрия или определенным сочетанием солей фосфата натрия и фосфата калия Для жизнедеятельности микроорганизмов большое значение имеет реакция среды — водородный показатель (рН), который определяется соотношением водородных (Н + ) и гидроксильных (ОН) ионов. Он представляет собой логарифм числа абсолютной концентрации водородных ионов.

Водородный показатель нейтральной реакции соответствует 7,0. В этом случае число водородных ионов равно числу гидроксильных. Показатель ниже 7,0 указывает на кислую реакцию, а выше 7,0 — на щелочную. Микроорганизмы приспособились развиваться в условиях с чрезвычайно широким диапазоном рН — от 2,0 до 8,5. Большинство сапрофитных и патогенных микроорганизмов культивируют при слабощелочной реакции среды с рН 7,2-7,4. Для культивирования молочнокислых бактерий, дрожжей и плесеней необходима кислая реакция среды, рН 5,0-6,5.

В настоящее время многие питательные среды выпускают в виде готовых сухих сред-полуфабрикатов, содержащих все необходимые для жизнедеятельности микроорганизмов ингредиенты. Для приготовления питательной среды порошок разводят водой, полученную смесь кипятят, устанавливают необходимое значение рН и стерилизуют.

Большое значение для роста и размножения микроорганизмов на искусственных питательных средах имеют температурные условия. По отношению к температурному режиму все микроорганизмы делят на три группы: психрофильные (холодолюбивые), мезофильные (средние), термофильные (теплолюбивые). Температурные границы размножения у психрофилов составляют от 0 до 20 °С, у мезофилов — от 20 до 45 °С, у термофилов — от 45 до 70 °С.

При выращивании аэробов посевы культивируют в термостатах при доступе кислорода воздуха, т. е. в обычных условиях. Для культивирования анаэробов создают бескислородные условия, которые можно достичь физическими, химическими и биологическими методами. Используют также анаэробные термостаты.

Физические методы основаны на создании вакуума в специальных аппаратах анаэростатах или в вакуум-эксикаторах, в которые сначала помещают посевы, а затем в аппаратах создают разрежение.

Иногда воздух в анаэростатах заменяют углекислым газом, азотом или другим инертным газом. Доступ кислорода в питательную среду можно затруднить, если культивировать анаэробов в глубине столбика питательного агара или внутри запаянных стеклянных трубок. Анаэробные условия можно создать и более простыми способами: с помощью слоя агара, залитого поверх посевов на плотной питательной среде, или с помощью вазелинового масла, которым покрывают жидкую питательную среду (среда Китта-Тароцци). Химические методы заключаются в том, что в эксикатор с посевами помещают химические вещества, например пирогаллол и щелочь, реакция между которыми идет с поглощением кислорода.

Биологический метод основан на одновременном культивировании аэробов и анаэробов на плотных питательных средах в герметически закупоренных чашках Петри. При этом кислород поглощается растущими аэробами, посеянными на одной половине среды, после чего начинается рост анаэробов, посев которых сделан на другой половине.

Дата добавления: 2014-01-05 ; Просмотров: 5073 ; Нарушение авторских прав? ;

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

studopedia.su

Искусственные питательные среды, их классификация. Требования, предъявляемые к питательным средам

В лабораторных или производственных условиях бактерии выращивают (культивируют) на средах, которые должны удовлетворять потребности бактерий в питательных веществах, иметь адекватное значение величины рН , изотоничность и быть стерильными, а по-возможности и прозрачными. Специфичность большинства питательных сред определяют соединения углерода и азота, но так как конструктивные и энергетические процессы микроорганизмов разнообразны, неодинаковы и их потребности в питательных веществах.
Питательные среды принято делить на несколько групп: среды которые отличаются по составу и происхождению, физическому состоянию или консистенции и функциональному или целевому назначению.
По происхождению среды бывают естественными (натуральными) и искусственными (синтетическими) . К естественным средам относят те, в состав которых входят продукты растительного или животного происхождения. Они содержат все компоненты, необходимые для роста и развития бактерий, но имеют непостоянный химический состав, то есть они нестабильны. Поэтому такие питательные среды не пригодны для изучения метаболизма бактерий, а ипользуются , в основном, для накопления биомассы, поддержания культур бактерий в жизнеспособном состоянии и для диагностических целей, например, для выделений чистых культур бактерий. К естественным средам относятся молоко, кровь и сыворотка крови, отвары и экстракты из природных субстратов, пептонная и мясная вода, мясо-пептонные бульон и агар , дрожжевые экстракты, картофельные, яичные и желчесодержащие среды.
Синтетические (искусственные) среды имеют определенный химический состав и точное количественное содержание питательных веществ. Их используют для изучения метаболизма бактерий, исследования физиологии и биохимии микроорганизмов. Примером синтетической среды могут служить среды Козера и Симмонса , используемые для изучения способности бактерий утилизировать цитраты. В состав этих сред, наряду с другими солями, входят цитрат натрия и индикатор.
В практике микробиологии, как правило, используются комбинированные питательные среды, в которых сочетаются естественные компоненты с неорганическими солями. Примерами таких сред являются агар Цейсслера , в состав которого входит МПА, кровь и сахар, среды Гисса , содержащие пептон, агар , один из сахаров и индикатор, среда Раппопорта , состоящая из желчного бульона, глюкозы и индикатора.
Среды можно по составу разделить так же на простые и сложные . К простым относятся мясная и пептонная вода, мясо-пептонные бульон и агар . Добавление к таким средам одного или нескольких ингредиентов — углеводов, крови, сыворотки и других составляющих делают их сложными.
По физическому состоянию питательные среды могут быть жидкими, полужидкими, плотными или твердыми, сыпучими или сухими . Жидкие среды представлены, как правило, водными растворами необходимых для жизни веществ. Их используют для накопления биомассы, обогащения культур бактерий, изучения метаболизма. Полужидкие и плотные питательные среды получают из жидких , добавляя к ним агар или желатину. Концентрация агара для полужидких сред 0,5-0,7%, а для плотных 1,5-2%.
Полисахарид агар получают из некоторых видов морских водорослей, его высушивают и хранят в виде пластин или порошка. Бактерии не используют агар в качестве субстрата и поэтому состав плотной питательной среды зависит от состава жидкой среды, к которой добавлен агар . Агар плавится примерно при температуре 100 ° С и застывает при 40 ° С. Агаризированные среды разливают в пробирки или чашки Петри в расплавленном состоянии, а затем охлаждают. Для уплотнения сред иногда используют желатину, добавляя ее к жидким средам в 10-20% концентрации. Применение желатины ограничено тем, что она разжижается протеолитическими ферментами бактерий и ее применяют , в основном, в питательных средах для диагностических целей. Для уплотнения сред используют, кроме того, селикогель и каррагенан , получаемый из красных морских водорослей. Пластины геля, пропитанные питательной средой, используют для культивирования бактерий-автотрофов.
Сухие питательные среды представляют смеси составляющих питательных сред определенного состава. Перед использованием их растворяют в воде в соответствии с инструкцией, указанной на этикетке, устанавливают необходимое значение рН и стерилизуют. Применение сухих питательных сред облегчает работу по приготовлению сложных сред в лабораториях.
По целевому назначению питательные среды делят на несколько групп:

  • основные или универсальные простые среды , например, МПА, МПБ; на них могут расти многие виды неприхотливых микроорганизмов;
  • специальные или сложные среды используют для культивирования тех бактерий, которые не могут расти на основных простых средах; в состав специальных сред вводят, например, углеводы для роста стрептококков, желчь для культивирования сальмонелл, дефибринированную кровь для дифтерийной палочки.

Среди сложных сред можно выделить избирательные или элективные среды. Они предназначены для выделения и культивирования определенного вида бактерий из материала, содержащего большое количество разных видов микроорганизмов. Например, для выделения возбудителя туберкулеза из мокроты больного используют среду Левинштейна-Йенсена , сальмонелл из испражнений — среду Плоскирева . В сложном составе таких сред содержатся вещества, ингибирующие рост посторонней микрофлоры, но не влияющие на жизнедеятельность искомого вида бактерий. Такими веществами могут быть анилиновые красители, желчь, хлористый натрий в концентрации выше 1%.
Разновидность элективных — селективные питательные среды . В их состав входят не только вещества, подавляющие рост отдельных групп микроорганизмов, но и стимуляторы роста отдельных видов бактерий.
Дифференциально-диагностические среды предназначены для идентификации бактерий по биохимическим свойствам. В основе использования этих сред лежат различия в ферментативном составе бактерий и способности ферментов расщеплять тот или иной субстрат. Существуют среды для определения гликолитической активности бактерий, в их состав входят один (среды Гисса ), два (среды Ресселя ) или три (среда Клиглера ) сахара. Протеолитическую активность бактерий изучают на МПБ, средах с желатиной, свернутой сыворотке. Возможность ферментировать более простые азотсодержащие соединения изучают на питательных средах с аминокислотами, бульоне с мочевиной.
Способность бактерий к выделению токсинов и ферментов агрессии исследуют на кровяных агарах , желточно-солевом агаре , безсывороточном фосфатном агаре и других подобных средах.
Консервирующие среды используют для транспортировки и хранения в течение длительного времени материала, содержащего бактерии. В их состав входят глицерин, хлорид натрия и фосфатно-буферные растворы.
Питательные среды стерилизуют в автоклавах при разных режимах, которые зависят от состава среды или, если питательные среды содержат термолабильные компоненты, путем стерилизующей фильтрации.

studopedia.org — Студопедия.Орг — 2014-2019 год. Студопедия не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования (0.001 с) .

studopedia.org

Лабораторная работа №3. Выращивание микробов на различных питательных средах

Лабораторная работа №3. Выращивание микробов на различных питательных средах

Цель: освоить основные методики приготовления искусственных питательных сред, наиболее широко применяемых в лабораториях.

Материалы и оборудование: сухая смесь (пептонно-агарная среда), водная баня, электронные весы, чашки Петри.

1) Приготовить пептонно-агарную питательную среду (смотреть методику ниже).

2) Залить питательную среду в чашки Петри (всего 4 шт.)

3) Взять пробы воздуха (из двух мест), воды и смывы с рук.

4) Ответить на вопросы.

5) Сделать вывод.

Искусственные питательные среды для бактерий Искусственные среды разделяют на животные [например, мясопептонный агар (МПА) или мясопептонный бульон (МПБ)] и растительные (например, настои сена и соломы, отвары злаков, дрожжей или фруктов, пивное сусло и др.). Естественные среды для выращивания бактерий Естественные питательные среды могут содержать компоненты животного (например, кровь, сыворотка, жёлчь) или растительного (например, кусочки овощей и фруктов) происхождения. По назначению выделяют консервирующие среды (для первичного посева и транспортировки), среды обогащения (для накопления определённой группы бактерий), среды для культивирования <универсальные простые, сложные специальные и для токсинообразования), среды дм выделения и накопления (консервирующие, обогащения и элективные) и среды для идентификации (дифференциальные и элективно-дифференциальные). Классификации питательных сред по загрязнённости материала Если материал слабо загрязнён посторонней микрофлорой, то для выделения чистых культур применяют простые (по составу) среды. При обильной контаминации сапрофитами используют специальные или элективные (для отдельных видов), селективные (только для отдельных бактерий), дифференциально-диагностические (для облегчений идентификации) среды.

Агар-агар получают из некоторых морских водорослей путем экстракции водой при кипячении. Образуемая масса представляет собой студень. Высококачественный агар-агар изготавливают из красных морских водорослей. По составу это сложное органическое соединение, в котором преобладают полисахариды (70 — 80 %). Готовый агар-агар слабожелтого цвета, имеет вид шнуров, пластинок или порошка. Плавится при температуре примерно 100 °С, застывает при 40 °С. При добавлении к среде придает ей плотность.

Пептон — продукт неполного распада белков, происходящего под действием ферментов в кислой среде. По составу это смесь полипептидов и некоторых аминокислот. Содержит вещества, необходимые для жизни многих микроорганизмов. Получают пептон из рубца крупного и мелкого рогатого скота. Препарат легко растворяется в воде, при нагревании не свертывается, не выпадает в осадок при добавлении в раствор солей.

Желатин — животный клей, состоящий из белка. Получают его путем варки хрящей, костей и сухожилий. Внешне он напоминает листочки светло-коричневого цвета, не имеет запаха и вкуса. Плавится при температуре 32 — 34 °С, застывает при 16 °С.

Мясопептонный агар (МПА) – среда искусственная, твёрдая, общего назначения. Представляет собой плотную студнеобразную массу. Питательная среда имеет вид студня светло-коричневого цвета и содержит:
— пептон сухой ферментативный — 10 г;
— натрий хлористый — 5 г;
— агар микробиологический — 13 г;
— мясной экстракт(из мяса крупного рогатого скота) — до 1 л.

Мясо-пептонный агар (МПА). Для приготовления рабочих сред навеску сухого порошка в количестве, указанном на этикетке (чаще 15-18 г), растворяют при нагревании в 300 мл дистил. воды, кипятят, помешивая, до образования быстрооседающей крупной пены, не допуская пригорания, охлаждают до 50°С, взбалтывают и разливают по бактериол. чашкам.

1. На аптекарских весах необходимо отвесить 0.66 грамма сухой смеси.

2. Высыпать в пробирку с 11 мл дистиллированной воды,

3. Поставить на водяную баню стакан с водой и поместить в него пробирку

4. Довести до кипения и оставить на 20 минут до получения равномерной желтоватой вязкой жидкости.

5. Перед разливом в чашки Петри среду охладить до 50°C, разливать слоем 4 — 6 мм. Разливку питательной среды лучше производить, когда она имеет температуру около 50°, так как при этом на крышках чашек не образуется капель воды в результате конденсации пара.

6. Подсушить питательную среду.

7. Произвести пробы воды, воздуха и смывы с рук. Пробы воздуха берутся в течение 1 минуты (крышка чашки Петри поднимается и засекается 60с, далее крышка закрывается). Студенты отправляются брать пробы в столовую и из вестибюля. Смывы с рук осуществляются следующим образом. Непосредственно перед взятием смыва ватную паочку увлажняют средой. При взятии смывов с рук протирают тампоном ладонные поверхности обеих рук, проводя не менее 5 раз по каждой ладони и пальцам, затем протирают межпальцевые пространства. Перед посевом смывов в пробирку с тампоном добавляют 5 мл 0,1% пептонной воды или изотонического раствора хлорида натрия. Тампон тщательно отмывают, после чего 1,0 мл смывной жидкости помещают в чашку Петри и заливают расплавленным МПА. Изотонический раствор соли получают, растоворяя 3 г NaСl и 220 мл дистиллята. Тампон тщательно отмывают, после чего 1,0 мл смывной жидкости помещают в чашку Петри и заливают расплавленным МПА. Аналогично берем пробу воды. Проба воды наносится на питательную среду.

8. Все пробы подписываются!

Вопросы для самоконтроля:

1. Для чего используют питательные среды?

2. Как подразделяются питательные среды по происхождению?

3. Какие компоненты используются для приготовления питательных сред?

4. Какие вещества служат для уплотнения сред?

pandia.ru

Научная электронная библиотека

Сибагатуллина А. М., Мазуркин П. М.,

2.4. Технология выращивания культуры водоросли

На практике наиболее распространенными методами биотестирования являются такие, в которых фиксируются, главным образом, такие интегральные параметры, как показатели выживаемости, роста, плодовитости тест-организмов.

Все методы биотестирования характеризуются своими особенностями. Это и доступность тест-объекта, которая определяется возможностью их культивирования в лабораторных условиях, поддержанием необходимых условий температуры, освещенности, сложностью состава питательных сред, чистотой воздуха и пр. Это и оперативность получения ответа.

Наиболее быстрые реакции на токсическое воздействие равных концентраций удается регистрировать у простых организмов – бактерий, водорослей и инфузорий. Наступление таких реакций ограничивается минутами или несколькими часами. Сутками измеряется проявление ответных реакций более крупных объектов (у ракообразных – дафний), а так называемая хроническая токсичность оценивается в течение многих суток и даже недель. Каждый метод характеризуется и своими техническими способами реализации. Общим правилом для всех методик является оценка надежности тест-культур.

В качестве тест – организма в наших экспериментах была использована одноклеточная зеленая водоросль Chlorella vulgaris. Данная водоросль легко культивируется (выращивается) на искусственных питательных средах и быстро размножается. Кроме этого, она широко распространена в природе и хорошо изучена учеными. В качестве питательной среды взята минеральная среда Тамия следующего состава (г/л): КNО3 – 5.0; MgSO4+7H2O – 2,5; KHPO4 – 1,25. Питательная среда и растворы солей готовятся на дистиллированной воде и не подвергаются стерилизации. Для избегания образования осадка, навеску каждого вещества сначала растворяют в небольшом количестве воды, а затем растворы сливают вместе в указанной выше последовательности и доливают воду до соответствующего объема. Перед внесением водорослей питательная среда (100%) разбавляется в 2 раза дистиллированной водой (50%).

.

Рис.2.2. Культиватор КВ-05

Наращивание исходной культуры водоросли производится в специальном культиваторе КВ-05, рис.2.2. В качестве реактора используется прозрачная бутыль из бесцветного стекла емкостью 400 мл. В реактор заливается суспензия водоросли в объеме 150мл. Для обеспечения углекислым газом, за счет растворения содержащегося в воздухе CO2 и перемешивания суспензии непрерывно вращается вокруг своей продольной оси. В процессе культивирования суспензия водоросли облучается светом лампы накаливания 40 Вт, 220В, установленный над реактором. Постоянная температура поддерживается автоматическим включением и выключением встроенного вентилятора по команде блока термостабилизации прибора.

Засев водоросли производится с начальной оптической плотностью 0,020±0,005. Для этого в 150 мл 50% питательной среды (среда Тамия, разбавленная дистиллированной водой в 2 раза) вносится 15 мл суспензии водоросли, профильтрованной через 3-4 слоя марли с оптической плотностью 0,220. Культура выращивается в полустационарном режиме, который достигается ежедневным пересевом в свежую среду. Такой режим культивирования позволяет без соблюдения условий стерильности поддерживать чистую культуру водоросли. При перерывах в работе свежевыращенную культуры водоросли можно хранить в холодильнике при температуре 2-4 °С в течение 2-4 месяцев. При возобновлении работ по биотестированию хранящуюся культуру водоросли следует активировать, прокультивировав одни сутки в культиваторе «КВ-05», как указано выше.

В качестве показателя светопропускания в приборе ИПТ-02, рис.2.3 используется величина оптической плотности, регистрируемая в круглой кювете («пенициллиновом» флаконе) на красном свету (длина волны 660 нм), который близок по спектру длинноволновому максимуму поглощения хлорофилла. Для уменьшения влияния оптической неоднородности стенок флакона на результаты измерения измерительный свет просвечивает кювету в трех направлениях.

.

Рис.2.3. Измеритель плотности ИПТ-02

Согласно основному закону светопоглощения, между величиной оптической плотности (D) и концентрацией растворенного вещества в измеряемом растворе существует прямопропорциональная зависимость. Аналогичная связь имеет место между D и количеством клеток в суспензии водоросли. Таким образом, через величину оптической плотности можно оперативно и достаточно точно определить насколько изменилась численность клеток в процессе роста культуры водоросли. Если не требуется высокая точность измерений, допустимо проводить измерение оптической плотности непосредственно во флаконах, в которых выращивались тест-культура. В этом случае после настройки прибора «ИПТ-02» по эталонной кювете с дистиллированной водой все флаконы культиватора «Фитотестер 03» последовательно помещаются в кюветный узел прибора.

Измерение температуры, которое также позволяет делать прибор «ИПТ-02» после его переключения в соответствующий режим работы (Т°), производится выносным датчиком. Чтобы обеспечить более точный и быстрый замер Т° необходимо делать несколько помешивающих движений термодатчиком в измеряемой среде. Для стабилизации температурного режима прибор должен быть включен за 15 минут до начала работы.

С целью изучения зависимости наиболее обобщенного показателя жизнедеятельности культуры водоросли – скорости ее роста – от факторов внешней среды, в том числе и тех, которые оказывают на нее токсическое воздействие, используется многореакторный культиватор «Фитотестер-03», рис.2.4. Данный культиватор представляет собой плоский прямоугольный блок разъемной конструкции, внутри которого расположена круглая кассета для установки в нее флаконов с суспензионными пробами тест-организма. Кассета приводится во вращение электродвигателем, что обеспечивает равномерное перемешивание содержимого всех реакторов и снабжение культуры водоросли углекислым газом, содержащимся в окружающем воздухе. Одинаковое облучение всех проб водоросли осуществляется лампой накаливания мощностью 40 Вт, расположенной внутри корпуса культиватора, рядом с кассетой. Лампа является не только источником световой энергии для фотосинтеза водорослей, но и нагревательным элементом, обеспечивающим нагрев проб тест-культуры.

.

Рис.2.4. Многокюветный культиватор водорослей (Фитотестор-03)

Для предотвращения перегрева реакторов в центре вращающей кассеты установлен вентилятор, который включается каждый раз, когда температура в корпусе прибора превышает установленный уровень. Последний задается термостатирующим устройством, также размещенным в культиваторе. После включения вентилятора происходит быстрое охлаждение внутреннего пространства культиватора более холодным внешним воздухом. При снижении температуры ниже требуемого вентилятор автоматически выключается. Таким образом, с помощью команд, подаваемых вентилятору, осуществляется процесс поддержания необходимой температуры в течение всего периода культивирования проб тест-организма [11].

www.monographies.ru

Читать еще:  Лучший сорт роз
Ссылка на основную публикацию
Adblock
detector